园艺植物病理学实验讲稿
生命科学与农林学院
2014年8月
目
录
实验一
植物病害症状的观察 实验二
植物病理徒手切片制作 实验三
真菌的形态观察
实验四
鞭毛菌亚门真菌形态观察 实验五
接合菌亚门真菌形态观察 实验六
子囊菌亚门真菌形态观察 实验七
担子菌亚门真菌形态观察 实验八
半知菌亚门真菌形态观察 实验九
培养基的制作 实验十
病原菌的分离培养 实验十一
植物的抗病性鉴定
实验一
植物病害症状的观察
一、实验目的
1.认识各类病害对植物造成的危害，了解植物病害的种类及其多样性，
2.初步掌握主要病害的症状表现及其特点，学会植物病害症状的描述，为今后病害的诊断奠定基础。
二、
实验原理
植物病害的症状是植物患病后由于异常生理活动而发生在细胞和组织上的病理变化，最后表现为肉眼可见的形态变化。有些症状也可用嗅觉、味觉或触摸进行观察。有的症状是单个细胞表现的症状，在这类症状中，最常见的是受某种病毒侵染的植株中所见到的细胞质内含体。
植物病害的症状可区别为两类不同性质的特征：病状和病征。病状是一定的寄主植物和病原在一定外界条件的影响下相互作用结果的外部表现，是以各自的生理机能或特性为基础的，而每种生物的生理机能，都是在质上有特异性，并且是相对稳定的。病变，作为这种相互作用过程的结果，一般说其发展是定向的。病状作为病变过程的表现，其特征也是较稳定的和具有特异性的。这就是利用病状诊断植物病害的基础。
病征是由病原微生物的群体或器官着生在病体表面所构成的，它更直接地暴露了病原物在质上的特点。如真菌子实体在寄主表面形成的霉层、黑点等。由植物病毒、植原体、许多病原细菌、非侵染性植物病害等没有病征的表现。病征的出现与否和出现的明显程度，虽受环境条件的影响很大，但一经表现出来却是相当稳定的特征，所以根据病征能够正确的判定病害。 不同植物的任何病害都具有其独特症状，通常在病害发生过程中按一定顺序出现。病理学家正是根据这种顺序出现的症状在田间诊断植物病害。
病状和病征，尤其是前者，作为诊断病害的依据也有其局限性。首先是许多植物病害常产生相似的病状，因此要从各方面的特点去综合判断；其次，植物常因作物品种的变化或受害器官的不同，而使病状有一定幅度的变化；第三，病害的发生发展是一个过程，有初期和后期，病状也随之而发展变化；第四，环境条件对病状和病征有一定的影响，尤其是湿度对病征的产生有显著地作用，加之发病后期病部往往会长出一些腐生菌的繁殖器官。因此，症状的稳定性和特异性只是相对的，要认识症状的特异性和变化的规律，在观察植物病害时，须认真地从症状的发展变化
中去研究和掌握症状的特殊性；观察和采集植物病害标本，仔细地区别病征的那种微小的、似同而异的特征，这样才能正确地诊断病害。
三、实验材料、试剂与器材
1.按照植物病害的病状类型（变色、坏死、斑点、腐烂、畸形）和病征类型（粉状物、霉状物、点状物、菌核、溢脓等）准备植物病害的盒装标本、瓶装浸渍标本及新鲜标本（不同类型的病状和病征的标本可根据当地的情况准备）。
2.各类症状的挂图、模型、多媒体课件等。 3.实体显微镜、手持扩大镜、水果刀、载玻片等。
四、实验步骤
（一）病状的观察
1．斑点 观察玉米大斑病、棉花角斑病、棉花黑斑病、大麦条纹病、小麦根腐叶斑病、大葱或大蒜紫斑病、花生网斑病、番茄早疫病、十字花科霜霉病等标本，注意不同类型病害所表现病斑的形状、大小、颜色等的异同以及病斑上有无轮纹、花纹伴生，同时注意观察各类病斑上有无病征以及病征的特点。斑点类发生在叶、茎、果等部位，受病组织局部坏死，一般有明显的边缘。斑点中还可以伴生轮纹、花纹等特点，根据病斑的颜色、形状等特点而分为褐斑、黑斑、紫斑、角斑、条斑、大斑、小斑、胡麻斑、轮纹斑、网斑等多种类型。
2．腐烂 观察甘薯黑斑病和干腐病病薯、马铃薯晚疫病和环腐病病薯、棉苗立枯病、柑桔溃疡病等病害标本，认识该类病害对植物所造成的危害，同时掌握这类病害的病状特点。腐烂类病状发生在植物的各个部位，由于组织分解的程度不同，有软腐、干腐之分。根据腐烂的部位，有根腐、基腐、茎腐、果腐、花腐等名称，还伴随有各种颜色变化的特点，如褐腐、白腐、黑腐等。
3．萎蔫 观察棉花、黄瓜等植物枯萎病、棉花和茄子黄萎病、玉米和茄科植物青枯病、马铃薯环腐病等标本，注意区别枯萎、黄萎、青枯等病状类型，必要时可以剖开病株茎杆观察微管束是否褐变。典型的萎蔫病状是植物根、茎的维官束组织受到破坏而发生的叶片或枝条萎垂现象，皮层组织完好，萎蔫病害常无外表的病征。植物受萎蔫菌侵染后，不一定都能引起萎蔫，发病初期有半边叶片、半个枝条萎垂的现象，但更常见的是全株性萎蔫。
提示 对于萎蔫类病害病状的观察应以新鲜标本为主，有条件时最好在田间进行，这类病害发生具有一定的地域性，观察时要注意其微管束组织的病变，干标本则失去了原有的特点。
4．变色 变色主要有两种类型。一种表现为黄化，是整个植株或叶片部分地或全部地均匀褪绿、变黄，或呈现其它的颜色。多数伴生有整株或部分的畸形。另一种为花叶，病株叶片色泽浓淡不均，深绿与浅绿部分相间夹杂，一般遍及全株，上部叶片较为显著，无病征表现。比较观察烟草花叶病、苹果花叶病、小麦黄矮病、瓜类、十字花科和茄科植物的病毒病病状、注意每一种病害的病状特点。
5．畸形 畸形类病状由不同组织、器官的病变，如叶片的膨肿、皱缩、小叶、蕨叶；果实的缩果及其它畸形；整个植株的徒长、矮缩；局部器官如花器和种子的退化变形和促进性的变态等。瘤、瘿、癌、丛枝和发根也是常见的畸形病状。观察桃缩叶病、十字花科根肿病、马铃薯癌肿病、果树根癌病、桑树根结线虫病、油菜白锈病、番茄蕨叶病、枣疯病、泡桐丛枝病、玉米黑粉病、小麦粒线虫病、水稻恶苗病等，归纳各类标本的病状类型。
（二）病征的观察
1．粉状物 借助手持扩大镜或实体解剖镜观察麦类锈病、十字花科白锈病、麦类白粉病、、玉米黑粉病和麦类黑粉病等病害标本，注意粉状物的颜色、质地和着生状况等。
2．霉状物 借助手持扩大镜或实体解剖镜观察黄瓜霜霉病、甘薯软腐病、瓜类软腐病、柑桔青霉病、番茄灰霉病和番茄叶霉病等病害标本或瓶装标本。注意区别霜霉、黑霉、绵霉、青霉和灰霉等不同类型的霉状物。
3．点状物 取小麦白粉病、瓜类炭疽病、棉花茎枯病、芹菜斑枯病、苹果树腐烂病和麦类赤霉病等病害标本，借助手持扩大镜或实体解剖镜观察，注意点状物是埋生、半埋生还是表生，以及在寄主表面的排列状况、颜色等。
4．菌核 观察油菜菌核病和水稻纹枯病等病害标本，注意菌核的大小、形状、颜色、质地等，并观察菌核萌发状况。
5．溢脓 溢浓为细菌性病害特有的病征。观察水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、十字花科细菌性软腐病、棉花角斑病和黄瓜角斑病等病害标本，注意溢脓的颜色、出现位置等。用剪刀将植物病组织剪成 4mm 2的小块，放于载玻片上，加一滴水，盖上盖玻片，在显微镜下观察或直接用载玻片对光观察喷菌现象。
五、实验报告及作业
将上述病害标本的发病部位，病状类型和病症类型，填于下表：
植物病害症状观察表
病害名称
发病部位
病状类型
病症类型
1.植物病害的主要特征是什么? 2.症状在病害诊断上有什么作用? 3.植物病害对农业生产的危害性如何?
实验二
植物病理徒手切片制作
一、
实验目的
观察植物病害病原物的形态，进行病原物的分类鉴定，研究受病组织的组织结构病变，受病植物组织与病原物的解剖学关系，以及对于难得一见病原物的保存备用等，都需将材料制成适当的显微玻片标本。因此，徒手制片技术也是植物病理学研究的重要手段之一。通过本次实验系统学习实践常用的徒手制片技术，为以后开展植物病理学的有关研究工作奠定坚实的制片技术基础。
二、
实验材料、试剂和器材 1．受病植物组织
2.解剖针、刀片、剃刀、移置环、酒精灯、载玻片、盖玻片、毛笔、浅玻皿、浮载剂、70%酒精、乳酚油、展片台、光学显微镜
三、
实验内容及方法
徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。 (一)
整体封藏法
对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。常用的方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。
1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辩不清。
取黄瓜霜霉病叶，小麦白粉病叶分别挑取霉状物和粉状物镜检病原菌的形态特点。
2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原蘸在载玻片的浮载剂
中封片镜检。浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。取玉米小斑病叶，在病斑背面刮制片，镜检分生孢子梗和分生孢子的形态。
3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。取小麦全蚀病或白粉病标本，拨小黑点制片，镜检子囊果的形态。
4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。
在毛毛雨天自田间取回感染白粉病的麦苗(或在保温箱中取接种染病的麦苗)。用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。 (二) 徒手切片法
欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。
徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。切片时先选取材料并作适当的修整，以左手的食指和姆指捏住材料，中指顶住材料下端，使材料上端突出于手指以上2—3毫米。右手握稳刀，从左向右后方斜向切割。注意刀口必须以材料面垂直。否则所得切面不正。同时双手不应紧靠身体，而是要活动自如。用臂力均匀地沿刀口后部起拉向前方，连续切割4—5片后，用毛笔蘸水轻轻沿刀口取下，放入盛有水的浅玻皿中，在此过程中左手握着的材料不要放下，否则再切时难按原位置拿材料，此外，在切片过程中，必须常用毛笔蘸水湿润材料，以免材料干涸不便切割。
对于过于柔软或较薄的材料，可以夹在“夹持物”中，进行切片更为方便。新鲜胡鲜卜和马铃薯块都可作“夹持物”用。实验室中通常将通草、接骨木或向日葵的茎髓，剪成适当大小，浸于70%酒精中备用。
切割一定数量的薄片后，用移置环在浅玻皿中选取合用的材料薄片，放在载玻片的水滴中，镜检合格者即酒精灯上将水烘干并摆正材料，然后加一滴乳酚油或其浮载剂；放在展片台上略加热，镜检如无气泡，即可小心加盖片，用吸水纸吸除多余的浮载剂，最后贴好标签，平放于切片板上，待干燥适宜时封固。
徒手切片的缺点是对于微小或过大，柔软、多汁、肉质及坚硬的材料不易切取，
也难制成连续切片，此外切片的厚薄也难一致。切片机切片即可克服这些缺点。
病名： 学名： 制片人： 时间：
切片的标签制法
四、实验报告及作业
1．每人交两片符合质量要求的玻片标本。
2.整体封藏法和徒手切片法两种基本徒手制片技术都在什么情况下使用? 徒手切法制片有什么优缺点? 怎样解决这种方法本身存在的问题? 附：常用浮载剂及封固剂
1.水作浮载剂：最常用，但易于干燥，仅适于暂时性检查，不易封固保存，且易形成气泡(检查材料以酒精、5%明胶、水或稀肥皂水稍浸，洗净后再以水浮载可除去气泡)。
2.乳酚油：也较常用，成分及配比如下：
苯酚结晶(加热熔化)20ml
乳酸20ml
甘油40ml
蒸馏水20ml
乳酚油不易干燥，标本可存放几天以上，为使标本易于辩别，常在其中加染料苯胺蓝(棉蓝)，用量是0.05—0.1%(也有的加0.2—0.5%的锥虫蓝等)，因其是酸性染料，可染真菌原生质而不染细胞壁，故对分隔难辨的真菌孢子等可由此染色而看清。此法一般只用观察菌态，不适于测量孢子的大小(因为乳酚油的折射率近于孢子和菌丝体，1.43左右)。另一方面，此法制片，封固比较困难(因为乳酚油易于和封固剂起化学作用而分解)，可用达马树脂(和乳酚油不起化学作用)和等量蜂蜡混配做封固剂，蜂蜡放于玻璃皿中在水槽上熔化(温度勿过高)，达马树脂在铁罐中熔化(温勿过度)，然后将蜂蜡倒入熔化的达马树脂中搅和而成(加少量的贴金胶水，可增进与玻璃的附着力)，封固时以“L”形铜棒等在煤气灯上烧热后，蘸少许封固剂在盖玻片周围封固，此封固剂干燥快，经久不坏。但由于其致癌作用而逐渐被淘汰而改用甘油乳酸液。
3.甘油乳酸液：也可加苯胺蓝等染料，其成分如下：
乳酸
500ml
甘油
1000ml
蒸馏水
500ml
4.水合氯醛碘液：成分配比如下：
水合氯醛
100g
碘化钾
5g
碘
1.5g
水
100ml
碘与碘化钾研和，加水溶解。然后与水合氯醛混合，此浮载剂较好，能使真菌组织透明，并染上颜色，能弥补乳酚油的不足，一一看清细胞壁和其它结构，此法制片只可保存几天，不宜久存，为保存，可除去碘液再用乳酚油浮载后封存。 5.甘油：此浮载剂适于保存藻类、水霉菌等柔软标本将标本放在一滴10%的甘油中，加盖玻片，水分蒸发后，随时补加甘油至水分蒸发净，制成的标本玻片平放可经久不坏，(擦去多余甘油，用香脂油或其它封固剂封固，可永久保存)。 6.甘油明胶：成分及配方如下：
明胶
5g
甘油
35ml
水
30ml
明胶在水中浸透，加热至35℃溶化，加甘油搅和，用纱布过滤后使用。
徒手切片及其它标本，都可用此剂浮载制片，标本染色(或不染)后，先用甘油脱水(干燥标本可不脱水)，挑取小团甘油明胶放在载片上，微加热，待其熔化而气泡消失后，将标本取出吸除去多余甘油后移入熔化的甘油明胶中，加盖玻片轻轻下压，擦去盖玻片周围的多余甘油明胶。平放十几天，干后长期保存，用香脂或其它固剂封固后长久保存。
此浮载剂对于干燥标本易出气泡，用醋酸甘油先予处理可防此弊，成分配比如下：
醋酸钾(2%水溶液) 300ml
甘油
120ml
酒精
180ml
标本放在载玻片上加小滴醋酸甘油，微加热以除气泡，并蒸去大部分油剂，趁热加入小团甘油明胶，熔化后加盖玻片，其后步骤同上。
实验三
真菌的形态观察
真菌分布广泛，种类繁多，已报导的将近
45000多种，是植物病原生物中最主要的一大类群，它所引起的病害占植物病害的80%以上，尽管真菌形态差异很大，但基本结构相似，大多数真菌有营养体和繁殖体之分，营养体是指吸收养分的器官，繁殖体是指从营养体上产生的各种类型的孢子。
真菌产生孢子的机构，无论是有形性的还是无性的，统称为子实体。真菌的孢子分为无性孢子和有性孢子两类。无性孢子有游动孢子、孢囊孢子、分生孢子和厚垣孢子；有性孢子有休眠孢子囊、卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担子孢子。真菌孢子的形态特征是鉴定和分类学上的重要依据，其营养体及其变态和菌组织体则是真菌分类的重要参考依据，有的还是重要的鉴别特征和分类依据。
一、实验目的
通过本次实验熟悉真菌的营养体和繁殖体的基本形态，为以后真菌病害的病原物鉴定和真菌分类奠定初步基础。
二、实验内容、材料和方法 (一)真菌的营养体 1菌丝和菌丝体
除少数原始的类群以外，真菌典型的营养体是极为细小的丝状体，这种丝状体称为菌丝，生长成丛的菌丝称为菌丝体，低等真菌的菌丝是无隔的，大多数真菌是有隔的。
(1)挑取马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)或瓜果腐霉病菌(Pythium aphanidermatum)制片，镜检无隔菌丝。
(2)挑取立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)制片镜检有隔菌丝。
(3)观察各种病原真菌在平面和斜面培养基上形成的菌落，注意菌落大小、形状、厚薄、质地、颜色等形态特点。 2菌丝组织体
有些真菌的菌丝体，在一定的条件下或一定的发育阶段，可形成特殊的组织体，常见有菌核、子座和根状菌索。
(1)菌核：菌核是由拟薄壁组织和疏丝组织形成的一种休眠体，既是真菌贮藏养分的器官，又是真菌用以度过不良环境的休眠机构，菌核大小不一，色泽和形状也各不相同。菌核中的菌丝组织已有分化现象，外皮组织细胞排列紧密，色深壁厚，具有保护作用，为拟薄壁组织；内层细胞壁薄色淡，排列疏松，仍可维持营养作用，为疏丝组织。
肉眼观察麦角病、油菜菌核病、黄瓜菌核病和大葱菌核病标本，比较菌核形状、大小、颜色；镜检细辛菌核病的菌核制片，注意比较表皮与内部组织细胞的排列特点。
(2)子座：子座是由拟薄壁组织和疏丝组织形成的容纳子实体的座垫状结构，或由菌丝体与部分寄主组织结合而成的称为假子座。子座是真菌从营养体到繁殖体的过渡机构，除可在其上或其内形成子实体外，也有度过不良环境的作用。
肉眼观察稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)的分生孢子座；镜检苹果树腐烂病菌(Valsa mali)和稻
香
柱菌(Epichloe typhina)所形成的子座制片，注意子座形状，着生部位及内部繁殖体类别。
(3)根状菌索：少数高等真菌的菌丝体还可纠结成绳索状的组织体，形如高等植物的根，故称根状菌索，其作用是帮助菌体蔓延和抵抗不良环境，根状菌萦组织也有表皮和内部组织的分化。
肉眼观察林木上根状菌索的外部形状，注意和菌核比较，找出二者区别。
3菌丝体上分化出的吸收养分组织
(1)吸器：是寄生在细胞间的真菌，特别是一些专性寄生菌在菌丝体上形成的吸收养分的器官，形状有球状、丝状、掌状、裂片状等。
镜检小麦白粉病菌(Blumeria graminis)吸器制备片，注意吸器的形状及其形成的部位。
(2)假根：为伸入基物内的菌丝体，形如高等植物的根系，故称假根。假根除用其吸收养分外，还有固着菌体的作用。
挑取培养基中培养的甘薯软腐病菌(Rhizopus nigricans)的菌丝(注意针尖要插入培养基内)制片镜检或镜检根足霉(Rhizopus sp.)制备片，注意假根与普通营养菌丝的区别。
(3)附着胞：从幻灯片或照片观察病菌侵染寄主植物形成附着胞的形态。
(4)菌环和菌网：捕食性真菌常由菌丝分化成菌环和菌网组织来捕捉线虫等小动物，然后再由菌丝侵入线虫体内吸取营养。 (二)真菌的繁殖体——孢子
真菌的繁殖方式分无性和有性两种，分别产生无性孢子和有性孢子两大类型。真菌的无性繁殖包括断裂、出芽和产生孢子等，真菌的有性生殖包括质配、核配和减数分裂三个阶段。
1无性孢子：不经过性细胞或性器官的结合便能产生孢子，称为无性孢子。真菌产生的无性孢子类型很多，主要的有游动孢子、孢囊孢子、分生孢子和厚垣孢子。
(1) 游动孢子：游动孢子为鞭毛菌亚门真菌特有的无性孢子，产生在由菌丝顶端细胞或由菌丝分化成的孢子囊梗的顶端细胞膨大形成的孢子囊内、具鞭毛，能游动。
制片镜检用线麻粒诱发的绵霉和水霉的游动孢子囊和游动孢子，镜检番茄晚疫病菌(Phytophthora infestans)的游动孢囊梗、游动孢子囊和游动孢子。 (2) 孢囊孢子：孢囊孢子为接合菌亚门真菌特有的无性孢子，生成方式和游动孢子相似，也是内生的，但无鞭毛，不能游动。
挑取黑根霉(Rhizopus sp.)制片(或取制备片)镜检孢子囊梗，孢子囊和孢囊孢子，注意观察孢子囊的形态及其着生位置及孢囊孢子的形态，颜色和产生的数目。 (3) 分生孢子：子囊菌亚门真菌和大部分半知菌亚门真菌都产生分生孢子，分生孢子外生在分生孢子梗上，形状、大小、颜色不一，单生，链生或集生，分生孢子梗
有的散生，有的束生，有的产生在分生孢子盘上或分生孢子器内，产生在分生孢子器内的分生孢子也叫器孢子。
取玉米大斑病(Exserohilum turcicum)的病叶，用刀片轻轻刮取病斑上的霉状物制片镜检分生孢子梗和分生孢子或挑取斜面培养基上培养的小麦根腐病菌(Bipolaris sativum)制片镜检分生孢子梗和分生孢子，另取苹果灰斑病(Phyllosticta pirina)制片镜检分生孢子器和器孢子，注意分生孢子的形状，色泽，细胞数目及着生情况。 (4) 厚垣孢子：镜检厚垣孢子制备片，菌丝中或孢子中个别细胞膨大、细胞壁加厚的孢子即厚垣孢子。
2有性孢子：由两个不同的性细胞或性器官相结合而产生的孢子叫有性孢子，有性孢子主要有以下4种。
(1) 卵孢子：部分鞭毛菌亚门真菌的有性孢子，由菌丝上产生的两种异形配子囊交配产生。制片镜检谷子白发病菌(Sclerospora graminicola)的卵孢子或镜检大豆霜霉病菌(Peronospora manshurica)卵孢子制备片，注意卵孢子形状、大小、颜色，孢壁形态。
(2) 接合孢子：为接合菌亚门真菌的有性孢子，由两个同形配子囊交配而成。镜检毛霉(Mucor)接合孢子制片，注意接合孢子的大小，形状，颜色及表现特点。 (3) 子囊孢子：为子囊菌亚门真菌产生的有性孢子，由两个异形配子囊交配生成，子囊孢子产生在子囊内，多为8个，子囊除极少数子囊菌裸生外，多数子囊菌生于子囊果中。取山楂白粉病(Podosphaera oxyacanthae)病叶，用解剖针将白粉上的小黑点(闭囊壳)仔细拨至载玻片上的水滴中，加盖片并轻轻压破闭囊壳，镜检闭囊壳，子囊、子囊孢子和附属丝的形态，特别注意子囊的数目和附属丝的特点，另取油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotium 132)制备片，镜检子囊盘、子囊和子囊孢子。
(4) 担孢子：为担子菌亚门真菌的有性孢子，由菌丝结合后减数分裂而成，外生于担子或先菌丝上。挑取萌发的玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)制片镜检冬孢子、先菌丝及担孢子的形态，另取小麦腥黑穗病菌(Tilletia caries)冬孢子萌发的制备
片，镜检冬孢子、先菌丝及担孢子的形态，比较两种黑粉病菌的区别。
另外还有一种有性孢子为休眠孢子囊，由两个游动配子结合而成，为二倍体，萌发时减数分裂释放出单倍体的游动孢子。如壶菌、根肿菌可产生休眠孢子囊，根肿菌产生的休眠孢子囊萌发时通常只释放出一个游动孢子，有时也称为休眠孢子。
三、实验报告及作业
1绘有隔菌丝，无隔菌丝和菌核剖面图。
2绘分生孢子、孢囊孢子、卵孢子及子囊孢子的形态图。 3菌丝有无隔膜是否反应一定的进化关系? 4菌核和子座在形态和功能上有何不同?
5真菌吸器的有无与寄生性的强弱是否有一定关系?
6分生孢子和孢囊孢子的生成过程，形成数量(与产孢细胞比较)及着生部位等方面
有何不同?
7卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担子孢子在有性生殖过程中形成的时期有何不同?
实验四
鞭毛菌亚门真菌形态观察
鞭毛菌是一类低等真菌，其中不少是水生的。它们的共同特征是无性繁殖时产生有鞭毛的游动孢子。根据菌体的形态和游动孢子鞭毛的特征分为根肿菌纲、壶菌纲、丝壶菌纲和卵菌纲。其中与植物病害关系较为密切的有根肿菌纲、壶菌纲、卵菌纲。
一、实验目的
了解鞭毛菌亚门中根肿菌纲、壶菌纲和卵菌纲真菌的主要形态特征，掌握与植物病害有关的重要属的形态特征、分类依据及所致病害的症状特点，同时学习使用检索表来鉴定病菌，为分类鉴定打下初步基础。
二、实验仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备；载玻片、盖玻片、浮载剂（蒸馏水或乳酚油）、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、刀片、通草、酒精灯、无菌水等。
三、实验材料
1．芸苔根肿菌（Plasmodiophora braicae） 2.马铃薯粉痂菌（Spongospora subterranea） 3．禾谷多粘霉（Polymyxa graminis）
4.玉蜀黍节壶菌（Physoderma maydis）
5．串囊水霉（Saprolegnia.monilifera）
6.稻绵霉（Achlya oryzae）
7.瓜果腐霉（Ｐythium aphanidermatum）
8.致病疫霉（Phytophthora infestans）
9.禾生指梗霉(Sclerospora graminicola)
10.葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）
11.寄生霜霉（Peronopora parasitica）
12.瓜类霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）
13.莴苣盘梗霉（Bremia lactucae）
14.十字花科白锈病菌（Albugo candida）
以上病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片，多媒体教学课件（包括幻灯片、录象带、光盘等影像资料）以及水霉和腐霉游动孢子形成与释放的录相带等。
四、实验内容和方法
（一）根肿菌纲（Plasmodiophoromycetes）
1.芸苔根肿菌 取甘蓝根肿菌切片，镜检切片中的病原菌。有的寄主细胞内可见到许多堆集在一起的鱼籽状颗粒，是病菌的休眠孢子。休眠孢子近球形。
2.马铃薯粉痂菌 镜检马铃薯粉痂病菌切片，在寄主根的皮层组织的受害细胞中可看
到病原菌的休眠孢子，球形至多角形，多个休眠孢子聚集呈海绵状或空心球。
3.禾谷多粘霉 选取有褐点的根，用解剖刀或镊子撕取小麦根基皮层，制成临时玻片，镜检。病菌的休眠孢子常有规律地呈条状排列。
提示 被寄生的表皮细胞呈褐色小点，必须仔细观察才能见到。
（二）壶菌纲（Chytridiomycetes）
玉蜀黍节壶菌（Physoderma maydis） 观察由玉蜀黍节壶菌引起的玉米褐斑病标本。用针挑取受害病组织内呈黄色粉末状物制成临时玻片，或对病组织作徒手切片，镜检可见到许多金黄色扁球状的休眠孢子，休眠孢子椭圆形，一面扁平有盖。
（三）卵菌纲(Oomycetes) 水霉目(Saprolegniales)
1.串囊水霉 引起水稻烂秧，又称水稻烂秧水霉菌。孢子囊圆筒形或棍棒状，层出式，即新的孢子囊从老的空孢子囊内基部长出，游动孢子具明显的两游现象。
2.水稻烂秧绵霉菌 孢子囊圆筒形或棍棒状，合轴分枝，新的孢子囊从老孢子囊的基部外侧长出，呈聚伞形排列，游动孢子第一个活动时期很短，休止孢在孢子囊顶部孔口处聚集成团。
霜霉目（Peronosorales）
1.腐霉属（Pythium） 观察瓜果的腐烂病病果上的白色菌丝体，将生长旺盛的小块菌丝体移至清水中培养24～48h，菌丝顶端即形成大量游动孢子囊，用针挑取在清水中培养过的菌丝，观察腐霉菌的游动孢子囊，丝状、姜瓣状或球状等，顶生或间生，无特殊分化的孢囊梗。孢子囊不脱落，萌发时在其顶端产生一管状物，原生质经管状物排出而形成泡囊。游动孢子产生在泡囊内。
2.疫霉属（Phytophthora） 取马铃薯或番茄晚疫病标本制片观察。孢囊梗2~3支成丛自气孔伸出，假轴状分枝，小梗基部膨大，多次产生孢子囊，使孢子囊梗上部呈节状；孢子囊近球状、卵形或梨形等，具乳突。
3.霜疫霉属（Peronophthora） 取荔枝霜疫霉病标本挑取霉层观察，孢囊梗直立，双叉锐角分枝，孢囊梗多级有限生长。孢子囊柠檬形、椭圆形，乳突明显。
4.霜霉属（Peronospora） 取十字花科植物（油菜、白菜等）的霜霉病标本从叶背面刮取霉层观察，孢囊梗二叉状锐角分枝，末端尖锐。
按照寄生霜霉的观察方法，选取禾生指梗霉、葡萄霜霉病菌、瓜类霜霉病菌、莴苣盘梗霉等材料，对照下列检索表，制片观察各种霜霉病的病原菌或观察病菌永久玻片标本，掌握霜霉科几个常见属的主要形态特征。 霜霉科主要属的检索表
1.孢囊梗粗壮，上部为重复2～3次的不规则二叉分枝…………指梗霉属（Sclerospora） 1.孢囊梗较细……………………………………………………………………………………2 2.孢囊梗单轴分枝，小轴与主轴成直角，分枝末端平钝………单轴霉属（Plasmopara） 2.孢囊梗呈现锐角二叉分枝……………………………………………………………………3 3.分枝两侧不对称，顶端尖锐……………………………假霜霉属（Pseudoperonospora） 3.分枝两侧对称…………………………………………………………………………………4 4.分枝顶端尖细……………………………………………………… 霜霉属（Peronospora） 4.分枝顶部膨大，呈盘状，具3～4个指状周生小梗…………………盘梗霉属（Bremia） 5.白锈菌属（Albugo） 镜检苋菜白锈病菌组织切片，或取以上病叶徒手切片制成临时玻片镜检。孢囊梗平行排列在寄主表皮下，短棍棒形，孢子囊串生。白锈菌危害症状是在寄主表面产生乳白色或粉状的疱斑，这是病菌在寄主表皮下形成的孢子囊堆，白色粉状物是成熟的孢子囊。
五、实验报告及作业
1.鞭毛菌亚门真菌的共同特征和分类依据是什么？
2.以营养体、无性繁殖、有性生殖来比较鞭毛菌亚门三个纲的区别。
3.观察十字花科蔬菜根肿病菌、马铃薯粉痂病菌、禾谷多粘霉菌、玉米褐斑病菌、水霉菌或绵霉菌，绘休眠孢子囊或游动孢子囊图。
4.绘瓜果腐霉病菌、马铃薯晚疫病菌或十字花科蔬菜白锈病菌孢囊梗、孢子囊，卵孢子图。
5.绘瓜类霜霉病菌、莴苣霜霉病菌、葡萄霜霉病菌孢囊梗、孢子囊图。 6.详绘大白菜霜霉病和粟白发病的病原形态图（包括无性繁殖和有性生殖）。 7.卵菌纲真菌有哪些特点？结合它们的生物学特性、寄生性及病害特点说明本纲真菌进化的情况。
实验五
接合菌亚门真菌形态观察
接合菌亚门真菌的共同特征是有性生殖产生接合孢子。大多数是腐生的，少数可以引起农产品的腐烂。接合菌营养体为发达的无隔菌丝体，无性繁殖产生具细胞壁的孢囊孢子，有性生殖产生接合孢子。孢子囊的形态、孢囊孢子释放以及寄生性等是重要的分类依据。
一、实验目的
通过实验掌握接合菌的一般形态及其所致病害的症状类型，了解同宗配合和异宗配合的含义及同型配子囊、异型配子囊的差别。
二、实验仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备；灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂（蒸馏水或乳酚油）、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子等。
三、实验材料
甘薯软腐病新鲜标本、挂图、病原菌永久玻片，多媒体教学课件（包括幻灯片、录象带、光盘等影像资料）等；根霉属的甘薯软腐病、犁头霉和毛霉“﹢、﹣”菌株的斜面培养物或培养皿平板培养物；三角瓶装PDA培养基。
四、实验内容和方法
（一）甘薯软腐病症状观察
受害甘薯变软腐烂，有时散发出酒味，病薯表面长出白色、灰色至黑色毛状物。仔细观察，能见到白色菌丝体中有许多小黑点。小黑点是病菌的孢子囊。
用针挑取霉层制片、镜检，观察孢子囊、孢囊孢子、孢囊梗及囊轴、假根的形态。
（二）匐枝根霉培养物的镜检观察
用挑针仔细地从培养的匐枝根霉菌中挑取少许连有培养基的培养物，制成临时玻片，在低倍镜下检查。或者用实体解剖镜直接观察培养皿上的菌体。观察菌丝的形态和具有分枝的孢囊梗及其基部的假根，孢囊梗之间有匍枝状的菌丝相连，在孢囊梗基部有深入寄主细胞或基质中分枝状的假根。在每一个孢囊梗的顶端产生一个圆球状的孢子囊，用高倍镜观察孢子囊内部的构造，在未成熟的孢子囊内，往往只有大量的小颗粒体，接近成熟的或成熟的孢子囊内则充满了许多褐色圆形的孢囊孢
子。孢子囊壁破裂后，孢子散出，露出锣锤形的囊轴。
（三）接合孢子观察
取根霉属和犁头霉属接合孢子玻片观察，并注意原配子囊、配囊柄及配子囊的发育特点。成熟的接合孢子深褐色，表面粗糙。犁头霉菌的接合孢子在配子囊柄的着生处有附属丝，注意观察配囊柄的形状及大小。
（四）异宗配合现象观察
取融化了的PDA培养基、灭菌培养皿置于铺有湿纱布的桌上，在洒精灯火焰附近，按无菌操作要求，将培养基倒进灭菌培养皿内，每个 9cm 皿内倒入10～15ml培养基，冷却后即成平板。取具有“﹢、﹣”性征分化并有亲和性的匐枝根霉、犁头霉或毛霉两个菌株，分别按下列图示方式接种到三个培养皿的平板上，在培养皿的底部写上所接种的菌株编号、接种日期，在 25°C 温箱中培养一周，观察异宗配合现象。记录哪个培养皿中形成了接合孢子。
五、实验报告及作业
1.接合菌亚门真菌的主要特点是什么？与鞭毛菌亚门有何区别？
2.根据+、-菌株平板接种培养结果，说明其产生接合孢子的原因？
3.何为同型配子囊、异型配子囊？
4.哪些接合菌与病虫害的生物防治有关？怎样利用它们？
5.绘匍枝根霉菌孢子囊、孢囊梗、孢囊孢子、假根、匍匐菌丝和接合孢子形态图。
实验六
子囊菌亚门真菌形态观察
子囊菌是一类高等真菌。菌丝体一般都很发达，有隔膜，具分枝，有的菌丝体可以形成菌核、子座等机构。子囊菌的共同特点是有性生殖产生子囊和子囊孢子。子囊菌所致病害的种类很多，其中许多是重要的经济作物病害。子囊菌亚门分纲的主要依据是子囊果及子实层的有无、子囊果的类型、子囊的特征等。据此分6个纲：半子囊菌纲、不整囊菌纲、核菌纲、腔菌纲、盘菌纲和虫囊菌纲。
一、实验目的
通过实验，了解子囊菌亚门各个纲病原菌的主要形态特征，掌握子囊菌中与植物病害有关的重要属的形态特征、分类依据及所致主要病害的症状特点。
二、实验仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备；灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂（蒸馏水或乳酚油）、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、刀片、通草、擦镜纸、无菌水等。
三、实验材料
1.桃缩叶病(Tapharina deformans)和李袋果病(T.pruni) 2.散囊菌(Eurotium sp.) 3.禾白粉病菌(Blumeria graminis)
4.向日葵白粉病菌(Erysiphe cichoracearum ) 5.瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)
6.桃白粉病菌(Podosphaera tridactyla) 7.洋槐白粉病菌(Microsphaera sp.)
8.桑里白粉病菌(Phyllactinia corylea) 9.葡萄白粉病菌(Uncinula necator)
10.甘薯黑斑病菌(Ceratocystis fimbriata) 11.玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)
12.苹果树腐烂病菌(Valsa mali) 13.小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis) 14.黑麦麦角菌(Claviceps purpurea) 15.竹多腔菌(Myriangium haraeanum)
16.葱叶枯病菌(Mycosphaerella sp.) 17.苜蓿轮纹病菌(Pleospora herbarum)
18.核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）
19.紫云英菌核病菌(S.trifoliorum)
以上病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片、多媒体教学课件（包括幻灯片、录象带、光盘等影像资料）。
四、实验内容和方法
（一）半子囊菌纲(Hemiascomycetes)
外囊菌属(Taphrina ) 取桃缩叶病或李袋果病材料作临时玻片，在显微镜下检
查。可看见子囊在寄主叶片的表皮下排列成栅栏状，形成无包被的子囊层，子囊下有足胞，常含孢子4～8个。子囊圆筒形，近球形或椭圆形。
（二）不整囊菌纲(Plectomycetes)
散囊菌属(Eurotium) 观察示范镜下散囊菌的闭囊壳、子囊或散在闭囊壳内的子囊孢子。闭囊壳壁薄，只有2~3层细胞构成。子囊孢子单胞、近圆形。
（三）核菌纲(Pyrenomycetes) 白粉菌目(Erysiphales)
本目是专性寄生菌。白粉菌侵染植物可引起多种植物的白粉病。白粉菌菌丝表生，在寄主体表扩展蔓延。一般在叶部引起褪绿或黄色斑，以后叶面出现白色或灰白色的粉状物，即白粉菌的无性繁殖形成的分生孢子。生长后期，在病部形成许多黑色小颗粒。这些小黑点是白粉菌的闭囊壳。闭囊壳有附属丝，附属丝呈丝状，其形态因种而异。闭囊壳内子囊数目也不一样，一至多个。附属丝的形状和子囊数目的多少是分属的依据。
选取小麦白粉病、向日葵白粉病、瓜白粉病、桃白粉病、洋槐白粉病、桑里白粉病、葡萄白粉病等不同材料。在实体解剖镜下观察闭囊壳及附属丝的轮廓及形态。挑取闭囊壳作临时玻片，在显微镜下检查。注意闭囊壳的形状、有无孔口、闭囊壳表面附属丝的形状和着生部位。然后轻轻挤压盖玻片，使闭囊壳破裂。观察闭囊壳内的子囊，数数是单子囊还是多子囊。
对照下列检索表，观察各种白粉病的病原菌永久玻片或标本，掌握白粉菌科几个常见属的主要形态特征及所致病害症状。 白粉菌主要属检索表
1.闭囊壳内单个子囊……………………………………………………………………………2 1.闭囊壳内多个子囊……………………………………………………………………………3 2.附属丝菌丝状…………………………………………………… 单囊壳属(Sphaerotheca) 2.附属丝刚直，较粗，顶端二叉状重复分枝，分枝末端螺旋状卷曲………… ………………………………………………………………叉丝单囊壳属(Podosphaera) 3.附属丝菌丝状…………………………………………………………………………………4 3.附属丝非菌丝状………………………………………………………………………………5 4.附属丝发育不良，较短……………………………………… 布氏白粉菌属（Blumeria）
4.附属丝较长………………………………………………………………粉菌属(Erysiphe) 5.附属丝刚直，基部膨大，顶端尖锐…………………………………球针壳属(Phyllactinia) 5.附属丝基部不膨大……………………………………………………………………………6 6.附属丝粗，刚直，顶端二叉状重复分枝，分枝末端卷曲……叉丝壳属(Microsphaera) 6.附属丝不分枝，顶端卷曲………………………………………… 钩丝壳属(Uncinula)
球壳菌目（Sphaeriales）
1.长喙壳属(Ceratocystis) 观察甘薯黑斑病菌培养物，挑取病菌灰白色物中间深褐色或黑色毛刺状小点，观察病菌的子囊壳。子囊壳深色、球形，有长颈，开口处有须状物，称口须。轻压盖玻片将子囊壳压破，成熟的子囊孢子头盔状，子囊壁早期胶化消解。
2.赤霉属（Gibberella） 取培养在麦粒上的玉蜀黍赤霉菌子囊壳，制成临时玻片镜检，在显微镜下观察。子囊壳蓝色或紫色，散生或聚生。子囊孢子多个细胞，梭形。
3.黑腐皮壳属（Valsa） 取苹果树腐烂病菌切片镜检，子囊壳埋生在子座内，有长颈伸出子座。子囊孢子单细胞，香蕉形。
4.顶囊壳属（Gaeumannomyces） 观察小麦全蚀病害标本，注意病株基部根系生长不良，茎基部叶鞘枯腐，叶鞘内有黑色小颗粒状物，即病菌的子囊壳。取含有子囊壳叶鞘做切片，置显微镜下观察子囊壳形态，子囊壳顶端有短喙；子囊孢子细线状，多细胞。
5.麦角菌属（Claviceps） 取黑麦麦角菌切片，置显微镜下观察，头状子座内壁周围有瓶状子囊壳，子囊壳开口向外。子囊壳内有子囊和子囊孢子。子囊细长，子囊孢子线形。
（四）腔菌纲(Loculoascomycetes)
1.多腔菌属（Myriangium） 取竹多腔菌切片置显微镜下观察，可见到很发达的子囊座组织。子囊球形，单生，子囊孢子有纵横隔膜, 砖格状。
2.球腔菌属（Mycosphaerella） 取葱叶枯病菌切片，置显微镜下观察,单腔多子囊。子囊圆柱形至棍棒形，有双层壁。子囊初期束生，后平行排列；子囊孢子椭圆形，双胞。
3.格孢腔菌属（(Pleospora) 取苜蓿轮纹病病菌切片，置显微镜下观察，囊孢子长圆
形或卵圆形，砖格状（多细胞，有纵横分隔）。
(五)盘菌纲(Discomycetes) 核盘菌属（Sclerotinia） 取油菜菌核病菌子囊盘切片，置显微镜下观察，子囊盘具长柄；子囊孢子椭圆形或纺锤形。观察油菜菌核病症状及菌核萌发标本，菌核球形至豆瓣形，鼠粪状，一般生子囊盘4～5个。菌核上形成的子囊盘具长柄。
五、实验报告及作业
1.子囊菌亚门各纲的主要特征是什么？ 2.绘外囊菌属和散囊菌属的形态图。
3.白粉属和单丝壳属、叉丝壳属和叉丝单囊壳属的主要区别是什么？ 4.绘白粉属、叉丝单囊壳属、球针壳属、钩丝壳属的形态图。 5.绘赤霉属、多腔菌属、核盘菌属形态图。 6.子囊菌有性繁殖体的病征类型和特点是什么？
实验七
担子菌亚门真菌形态观察
担子菌亚门真菌一般称作担子菌，是真菌中最高等的。其共同特征是有性生殖产生担孢子。担子菌亚门的分纲依据是担子果的有无，担子果的发育类型可分为三个纲：冬孢菌纲、层菌纲、腹菌纲。与植物病害关系密切的是冬孢菌纲。根据担子的来源及特征，担孢子的数目及位置，冬孢菌纲分为锈菌目和黑粉菌目。锈菌的分类主要依据冬孢子的形态，排列和萌发的方式。而黑粉菌的分类主要依据冬孢子的萌发方式，孢子的分隔，排列及其大小，形状及是否有不孕细胞等进行分类。
一、实验目的
通过实验了解担子菌亚门冬孢菌纲主要病原菌的形态特征，掌握锈菌目和黑粉菌目中与植物病害有关的重要属的形态特征、分类依据及所致主要病害的症状特点。
二、实验仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备，灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂（蒸馏水或乳酚油）、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、蒸馏水滴瓶、通草、刀片、擦镜纸、酒精灯、无菌水、PDA培养基等。
三、实验材料
锈菌目（Uredinales）：
1.菜豆锈菌（Uromyces.appendiculatus） 2.禾柄锈菌（Puccinia graminis f.sp.tritici） 3.禾叶锈菌（Puccinia recondita）
4.禾条锈菌（Puccinia striiformis）
5.梨胶锈菌（Gymnosporangium haraeanum） 6.蔷薇多胞锈菌（Phragmidium rosae-multiflorae）7.亚麻锈菌（Melampsora lini）
8.花椒鞘锈菌（Coleosporium xanthoxyli） 9.松栎锈菌（Cronartium quercum）
10.枣层锈菌（Phakopsora zizyphi-vulgaris）
黑粉菌目（Ustilaginales）：
1.小麦散黑粉菌（Ustilago tritici）
2.玉蜀黍黑粉菌（U.maydis）
3.丝轴黑粉菌（Sphacelotheca reiliana）
4.高粱坚粒黑粉菌（Sphacelotheca sorghi） 5.高粱散粒黑粉菌（Sphacelotheca cruenta） 6.高粱团黑粉菌（Sorosporium ehrenbergii） 7.小麦网腥黑穗菌（Tilletia caries）
8.小麦光腥黑穗菌（Tilletia tritici） 9.稻尾孢黑粉菌（Neovoia horrida）
10.稻叶黑粉菌（Entyloma oryzae） 11.小麦条黑粉菌（Urocystis tritici）
以上病菌引起的病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片和病菌的PDA培养物;多媒体教学课件（包括幻灯片、录象带、光盘等影像资料）。
四、实验内容和方法
（一）冬孢子萌发试验
冬孢菌纲不同类型冬孢子萌发方法是不同的，几种常见的冬孢子的萌发方法如下：
1．小麦网腥黑穗菌和光腥黑穗菌 将冬孢子撒在保湿器皿内的用1%硝酸钙液润湿的滤纸上，在17～ 22℃ 下培养，每天于日光灯下照射4h，3d后检查萌发情况。
2．小麦条锈病菌 取带冬孢子病叶在0.5～1%柠檬酸中浸15min，再放于两层潮湿的滤纸之间，于-2~ -5℃ 下冷冻5d后，挑取冬孢子置于水滴内，在冰箱内（ 4℃ ）保存48h即可萌发。
（二）锈菌目（Uredinales）
1.单胞锈菌属（Uromyces） 观察菜豆锈病或茭白锈病标本，挑取冬孢子制成玻片观察。冬孢子具柄，单细胞。
2.柄锈菌属 观察小麦杆锈病、小麦叶锈病或小麦条锈病标本，冬孢子堆黑色。将有冬孢子堆的寄主叶片组织切下，制切片于显微镜下观察。冬孢子有一隔膜，分隔处稍缢缩，柄不胶化。
4.胶锈菌属（Gymnosporangium） 从用水浸泡过的胶锈菌冬孢子角上用挑针挑取冬孢子制片观察，冬孢子双胞，分隔处不缢缩或稍缢缩。柄丝状，很长，含胶质。
5.多胞锈属（Phragmidium） 挑取玫瑰锈病组织上的冬孢子，制片观察，冬孢子多细胞，通常下部膨大易胶化。
6.栅锈菌属（Melampsora） 取亚麻锈菌病组织制作徒手切片观察。冬孢子无柄，集成壳状或垫状，冬孢子仅侧面结合成一层，埋生于寄主表皮下。
7.鞘锈菌属（Coleosporium） 取花椒锈病组织制作切片观察，冬孢子堆生于叶背或排列成环状，圆形黄褐色。冬孢子无柄，集成壳状或垫状的孢子粒，集生于寄主表皮层下。
8.柱锈菌属（Cronartium） 取马尾松锈病标本制片观察，冬孢子堆生于叶背，毛状，冬孢子梭形。
9.层锈菌属（Phakopsora） 取枣锈病组织制作切片观察，冬孢子堆呈黑色，冬孢子
排成2～4层，长椭圆形或多角形。
（三）黑粉菌目（Ustilaginales）
1.黑粉菌属（Ustilago） 孢子堆外露，很少由寄主组织长期包裹，担子分隔，担孢子生在担子每一细胞的侧面。
挑取小麦散黑粉（穗）病组织上的冬孢子制成玻片观察。冬孢子球形或近球形。另取冬孢子萌发切片观察。冬孢子萌发产生4个细胞的担子，从担子的不同细胞分别生出丝状分枝，不产生担孢子。
挑取玉米瘤黑粉病组织上的冬孢子制片观察，冬孢子球形至卵形。另取冬孢子萌发切片观察。冬孢子萌发时产生有隔担子，担子顶端或分隔处侧生梭形的担孢子。
2.轴黑粉菌属（Sphacelotheca） 冬孢子堆周围有膜（不孕菌丝），中央有寄主组织，担子分隔，担孢子生在担子每一细胞的侧面。
挑取高粱丝黑穗病组织上的冬孢子制片观察。冬孢子卵圆形或球形，暗褐色，有时混生有不孕细胞，不孕细胞无色透明。
取高粱坚粒黑穗病标本观察。孢子堆生于子房中，冬孢子多圆形或近圆形，不孕细胞长圆形至近圆形。
取高粱散粒黑穗病标本观察。冬孢子堆有由菌丝体组成的灰白色被膜，冬孢子球形，分散。
3.团黑粉菌属（Sorosporium） 观察高粱长粒黑穗病标本，病粒（即菌瘿）外层包有一层浅黄色薄膜。孢子堆结合成孢子球，孢子球的结合很松。稍加压就分散，无不孕细胞。
4.腥黑粉菌属（Tilletia） 取小麦网腥黑穗病或小麦光腥黑穗病标本观察。冬孢子单生，孢子堆成熟时呈粉未状，冬孢子较小。孢子堆生于子房内，外包果皮，内部充满黑紫色粉状孢子，有腥味。
5.尾孢黑粉菌属（Neovoia） 取水稻粒黑穗病标本挑片观察，孢子堆寄生于子房内，产生黑粉。挑取黑粉制片，显微镜下可见，孢子球形，常有一部分未成熟的透明孢子。
6.叶黑粉菌属（Entyloma） 取水稻叶黑粉病标本，切片观察。孢子堆生于叶的两面，圆形至长条形。孢子多角形，结合紧密。取萌发的担孢子玻片观察，担孢子顶
生于担子上，纺锤形。
7.条黑粉菌属（Urocystis） 取小麦秆黑粉病标本，制片观察。一至多个厚垣孢子集结成牢固的孢子球，孢子球外有淡色而小的不孕细胞包围。
五、实验报告及作业
1.绘黑粉菌属、腥黑粉菌属和条黑粉菌属冬孢子形态图。 2.绘腥黑粉菌属冬孢子萌发图。
3.绘柄锈菌属、单胞锈菌属、栅锈菌属和胶锈菌属冬孢子形态图。
实验八
半知菌亚门真菌形态观察
半知菌亚门真菌的种类很多，其中不少是植物病害的重要病原菌。半知菌的分类主要是根据无性阶段的形态特征，包括分生孢子的形态、载孢体的类型、产孢方式等。半知菌亚门分3个纲。芽孢纲：营养体为单细胞或发育程度不同的菌丝体或假菌丝，通过产生芽孢子繁殖；丝孢纲：营养体是发达的菌丝体，分生孢子不产生在分生孢子盘或分生孢子器内；腔孢纲：分生孢子产生在分生孢子盘或分生孢子器内。与植物病害关系比较密切的是丝孢纲和腔孢纲。
一、实验目的
通过实验认识半知菌子实体的类型及重要致病菌属的形态特征，掌握常见植物病原半知菌属的鉴别特征。
二、实验仪器与用品
显微镜、幻灯机、投影仪、计算机及多媒体教学设备，灭菌培养皿、载玻片、盖玻片、浮载剂（蒸馏水或乳酚油）、吸水纸、解剖刀、挑针、镊子、纱布、刀片、通草、酒精灯、放大镜，恒温箱，方木块，剪刀等。
三、实验材料
半知菌引起的病害标本或新鲜材料、挂图、病原菌永久玻片和病菌的PDA培养物；多媒体教学课件（包括幻灯片、录象带、光盘等影像资料）。
丝孢纲（Hyphomycetes）
1.立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）
2.齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）
3.稻梨孢（Pyricularia oryzae）
4.玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolaris maydis）
5.玉米大斑突脐蠕孢（Exserohilum turcicum）
6.大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）
7.芸苔链格孢（Alternaria braicae）
8.球座尾孢（Cercospora personata）
9.梨黑星孢（Fusicladium virescens）
10.灰葡萄孢（Botrytis cinerea）
11.粉红聚端孢（Trichothecium roseum）
12.意大利青霉（Penicillium italicum）
13.褐孢霉（Fulvia fulva）
14.尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）
腔孢纲（Coelomycetes）
1.胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）2.葡萄痂圆孢（Sphaceloma ampelinum）
3.梨壳囊孢（Cytospora carphosperma）
4.芹菜生壳针孢（Septoria apiicola）
5.高粱生壳二孢（Ascochyta sorghina）
6.甜菜蛇眼病菌（Phoma beta）
7.梨叶点霉（Phyllosticta pyrina）
四、实验内容和方法
（一）丝孢纲
1.丝核菌属（Rhizoctonia） 观察预先培养的棉花立枯病菌或小麦纹枯病菌菌落。菌核褐色至黑褐色。挑取菌丝制片观察，菌丝粗壮，菌丝分枝呈直角，分隔处常缢缩。
2.小核菌属（Sclerotium） 取花生白绢病或小麦、大豆、棉花、烟草等白绢病菌标本或培养观察，病菌菌丝白色绢丝状；菌核圆形至长圆形，褐色至黑色，表面暗色，中心无色，组织致密，干时极硬，彼此无菌丝相连。
3.梨孢属（Pyricularia） 取水稻稻瘟病标本，用挑针挑取病叶上的霉状物制片观察。分生孢子梗细长，淡褐色，顶部以合轴式延伸，呈曲膝状，分生孢子多胞，梨形。
4.平脐蠕孢属（Bipolaris） 取玉米小斑病叶，挑取病斑上的霉层观察。分生孢子梗单生或丛生，上部呈曲膝状弯曲；分生孢子蠕虫形或长椭圆形，多胞，脐点稍微突出，平截状。
5.突脐蠕孢属（Exserohilum） 取玉米大斑病病叶，用挑针挑或刮取其上的黑色霉状物制片，置显微镜下观察。其分生孢子梗暗色，具分隔，一般少分枝，上部呈曲膝状。分生孢子棱形，多胞，脐点明显突出于基细胞外部。
提示 观察时注意与平脐蠕孢属的区别，主要在于其脐点是否突出。
6．镰孢属（Fusarium） 取瓜类枯萎病菌培养观察，气生菌丝白色，绒毛状，在PDA培养基上底部呈淡黄色或淡紫色；挑针挑取培养物制片观察，小型分生孢子量大，无色，卵圆形，单胞，偶尔双胞；大型分生孢子无色，纺锺形或镰刀形，1～5个隔膜，基部有时有一显著的突起，称足胞。
提示 有时可观察到厚垣孢子，顶生或间生于菌丝体上。
7.轮枝孢属（Verticillium） 取培养好的棉花黄萎病菌平皿，直接放于显微镜载物台上观察，其分生孢子梗细长直立具分隔，呈轮状分枝。分生孢子梗呈直角分枝，分生孢子单胞，生于分枝顶端。
提示 培养菌用的培养基不宜太厚以便透射光能穿透，平皿放到载物台上小心移动，使视野覆盖菌落边缘，这样才能找到理想的轮状分枝结构。
8.链格孢属（Alternaria） 取白菜黑斑病病叶，用挑针挑取病斑上的黑色霉状物制片，显微镜下观察。分生孢子长棍棒状，具纵横分隔，呈砖格状，顶端有一长条形喙状细胞。
9.尾孢属（Cercospora） 取芹菜早疫病（斑点病）病叶，挑取霉层制片，分生孢子梗不分枝或少有分枝；分生孢子单生，鞭状，具多数分隔。
10.黑星孢属（Fusicladium） 挑取梨黑星病叶上的煤烟状霉层制片，分生孢子梗暗色，顶部稍屈曲，孢痕明显；分生孢子淡褐色，1～2胞，瓜子形。
提示 注意分生孢子梗的孢痕，在显微镜透射光源照射下呈现亮点。
11.葡萄孢属（Botrytis） 取黄瓜或番茄灰霉病标本，挑取其上的灰霉状物制片观察。分生孢子梗顶端分枝，末端膨大并产生小突起，其上着生多数分生孢子，外观呈葡萄穗状。
12.聚端孢属（Trichothecium） 取棉铃红粉病标本，挑取霉层制片观察，分生孢子梗直立，少分隔或不分隔，分生孢子无色双胞，洋梨形，常以基部交错相连的方式在孢子梗顶端聚集成孢子链。
13.青霉属（Penicillium） 取柑桔青霉病标本或病菌培养，挑片观察。分生孢子梗集结成束，“扫帚状”分枝，分枝末端为瓶状小梗，生孢子着生在瓶状小梗上。
14 褐孢霉属（Fulvia） 取番茄叶霉病标本，挑取霉层制片显微镜下观察。分生孢子梗基部细，上部粗，分生孢子串生，孢子链常分枝并有芽状突起。
（二）腔孢纲
1.炭疽菌属（Colletotrichum） 取苹果炭疽病标本制片观察，分生孢子盘埋生于寄主表皮下，垫状无刚毛，成熟后突破表皮，分生孢子梗平行排列成一层，分生孢子单胞。
提示 切片时最好用新鲜采集的标本，如果标本干燥可用蒸馏水湿润一下再进行切片，切出的丝条越薄越好，若用乳酚油作浮载剂效果更好。
2.痂圆孢属（Sphaceloma） 取葡萄黑痘病标本，切片观察，孢子梗排列紧密，自盘状子座基部产生；分生孢子盘黑色；分生孢子梗极短，紧密排列于子座上，分生孢子无色单胞，中部缢缩，内含1—2个油球。
3．壳囊孢属（Cytospora） 取梨树腐烂病病树皮，徒手切片观察，子座暗褐色，多腔室，似迷宫状，分生孢子器着生于瘤状子座组织内；分生孢子香蕉形。分生孢子与胶体物质混合，吸水膨胀后连同孢子自孔口挤出成为分生孢子角。
4．壳针孢属（Septoria） 取芹菜斑枯病病叶，做徒手切片，分生孢子器球形；分生孢子无色，针状，多胞。
提示 分生孢子的横隔须经染色后才能观察清楚；切片操作的最后一步即将切片放到载物台上时再加水浮载样品，这样立即观察可看到分生孢子自孔口向外喷射的现象。
5.壳二孢属（Ascochyta） 取高粱粗斑病标本制作切片观察，分生孢子器黑色，分生孢子器扁球形，分生孢子圆筒形，双胞无色。
6．茎点霉属（Phoma） 取甜菜蛇眼病标本，切片观察，分生孢子器着生于寄主表皮下，呈轮纹状排列，分生孢子器球形，分生孢子无色单胞，卵圆形。
7．叶点霉属（Phyllosticta） 多寄生于叶上。取苹果灰斑病叶，制作徒手切片观察，分生孢子器球形，有孔口，分生孢子极小（小于15μm），卵圆形。
提示 叶点霉属的形态与茎点霉属很难区分，应结合发病部位一起认识。
五、实验报告及作业
1.绘梨孢属、尾孢属和镰孢霉属的分生孢子梗和分生孢子形态图。 2. 绘炭疽菌属、盘二孢属的分生孢子盘和分生孢子形态图。
实验九
培养基的制作
一、实验目的
了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。
二、
实验原理
在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水份等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH值范围。
培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5～2%的琼脂，半固体培养基是加入0.2～0.5%的琼脂。琼脂（agar）又称琼胶或洋菜，是由海藻加工而成，其化学性质稳定，一般微生物均不能分解利用。它在 95℃ 热水中溶化成溶胶，冷却到 45℃ 以下时又重新凝固，故一般实验中常用它作为凝固剂。
根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基（PDA），肉汁胨培养基（NA）等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，没有任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏（Czapek）培养基等。
根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。
在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。
三、
实验材料、试剂与仪器
1．材料 马铃薯。
2．试剂 葡萄糖、琼脂等。
3．仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（或酸度计）、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。
四、
实验步骤
PDA培养基（马铃薯葡萄糖培养基）配方
去皮马铃薯 200g
葡萄糖 20g 琼脂 15～20g
蒸馏水 1000ml 自然pH
在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。 1．称量 称量去皮马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂15-20g 。
提示 琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的 15g 就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。
2．将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000ml，煮沸30min。用纱布滤去马铃薯残渣。
3．将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。
提示在琼脂融化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
4．加入葡萄糖。葡萄糖容溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000ml。
提示 通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，1000ml，2000ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。
5．分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
6．加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。 正确的棉塞是形状、大小、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1/3在外，2/3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。如不使用棉塞也可用橡皮塞或特制的金属、塑料试管帽，为让空气可以自由进出，橡皮塞不要过紧，灭菌前应夹一纱线在管口。
7．包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等
8．灭菌 将上述培养基以0.103Mpa， 121C , 高压蒸气灭菌20min。
9．搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至 50C 左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
培养基经灭菌后，必须放在 37℃ 温箱培养24h，无菌生长者方可使用。 PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
提示 pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制低pH的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。
五、实验报告及作业
各组上交按计划制备的培养基。
1．为什么有的培养基要调pH值，有的可以不调
2．加压蒸气灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短
3．想一想，试一试，将几只试管包扎在一起比较牢固？
