实验一 显微镜的构造和使用方法
一、实验目的及要求
1.了解显微镜的构造和性能 2.掌握显微镜的正确使用和维护方法
二、原 理
微生物最显著的特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察它们的个体形态和细胞构造，熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。本实验主要介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和使用方法，目的在于使同学们通过本实验，对光学显微镜有比较全面的了解，并重点掌握明视野普通光学显微镜中油镜的使用。
三、显微镜的构造和性能
1.构造（1）机械系统：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、
推进器、调节螺旋。
（2）光学系统：目镜、物镜、聚光器、反光镜、滤光片。
2.性能（1）分辨力和数值孔径
分辨力用D表示，D=0.5×(λ/N.A)
N.A=n×Sin(α/2)
N.A为数值孔径；λ为入射光波长；n为介质折射率。α为镜口角。
（2）放大倍数
放大倍数 = 物镜的放大倍数×目镜的放大倍数
四、实验器材
显微镜、标本、擦镜纸、香柏油、二甲苯
五、显微镜的使用方法
1、对光：光强时用平面镜，光弱时用凹面镜，视野明亮即可。
2、镜检：低倍镜——定位；高倍镜——观察；油镜——观察
3、镜检完毕后的工作：擦拭镜头（标本）等，还原显微镜，登记，洗手，离开。
4、总流程：安装—调光源—调目镜—调聚光器—镜检—擦镜头——复原—登记。
六、作业（可选）
1、哪些方法可以提高显微镜的分辨率？
2、
2、为什么有时候在低倍镜下可看到的目标，换用高倍镜则无法看到？
实验二 细菌、放线菌的形态观察
一、实验目的及要求
1.掌握细菌的制片和染色技术 2.掌握放线菌形态观察方法 3.熟练油镜的使用方法
二、细菌染色的基本原理 1.革兰氏染色
G＋与G－细胞壁结构不同，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇进行脱色时，G＋细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，乙醇脱色使肽聚糖的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在胞内，经脱色处理时，初染剂保留而呈现紫色。G－菌肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高, 乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。 2.简单染色
细菌细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。细菌常用碱性染料来进行简单染色，这是因为在中性，碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，很容易使细菌结合使菌体着色，经染色
后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
三、实验材料
1、菌种
金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、大肠杆菌、灰色链霉菌
2、器材
显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、香柏油、碱性染料等。
四、方法和步骤 1.细菌简单染色
取菌（要求无菌操作）——涂片——干燥——固定——染色（1min）——水洗——干燥——镜检（形状、大小、排列方式） 2.放线菌菌落形态观察
（1）表面形状
大小、颜色、边缘、紧密程度等。 （2）区别营养菌丝、气生菌丝、孢子丝 3.气生菌丝、孢子丝的活体观察
将培养皿盖打开，选择菌丝和孢子丝生长较薄的部位，直接用低倍镜和高倍镜观察。
4．气生菌丝、孢子丝的印片观察
载玻片——滴1滴美兰染液——盖玻片印片——印片面向下置于美兰中——吸去多余染液——镜检（用油镜观察）——维护还原显微镜。
五、作业
1、绘出所观察的几种细菌和放线菌的形态并注明名称和放大倍数。
2、放线菌菌落和细菌菌落有何不同之处？
3、放细菌的菌体为何不易挑取？
实验三 酵母菌和接合菌的形态观察
一、实验目的及要求
1、掌握酵母菌和接合菌菌落及个体主要形态特征。
2、掌握观察酵母菌和接合菌个体形态的制片方法。
二、实验材料
1、菌种
啤酒酵母，黑根霉，高大毛霉
2、器材
显微镜，载玻片，盖玻片，接种钩，酒精灯，无菌水，乳酸苯酚，吸水纸等。
三、实验方法 1.酵母菌菌落的观察
菌落颜色、光泽、质地、表面特征等。 2.酵母菌细胞形态观察（水浸片法）
无菌水滴加于载玻片上——取菌——涂片——盖上盖玻片——镜检（10倍定位，40倍观察芽殖）。
注:亮的区域为液泡，看不到细胞核，核须染色才可见到。 3.接合菌活体观察 （1）肉眼观察
（2）显微镜观察
打开培养皿盖，将盖倒置，在低倍镜下观察，注意假根和匍匐丝的结构，孢囊结构和孢囊孢子。 4.接合菌制片观察：
载玻片——1滴乳酸苯酚——顺一个方向钩取少量菌丝——盖玻片剥离飘落于乳酸苯酚——加盖玻片——镜检 注意：乳酸酚不必加热，孢囊在制片时已大多被破坏。
区别孢囊与气泡在显微镜下的差别：气泡会吸附大量孢子，且中央亮，两边暗，而孢囊中间厚，整个区域都暗。
四、作业
1、画出供试菌典型结构（不是在一个视野可全部看到），并注明放大倍数和名称。
2、比较酵母菌、放线菌和细菌的菌落特征。
实验四 青霉和曲霉的形态观察
一、实验目的
1、掌握曲霉、青霉菌落和个体形态特征。
2、掌握观察曲霉、青霉的主要形态特征的制片方法。
二、实验材料
1、实验菌种
灰绿曲霉，黑曲霉，黄曲霉、青霉等。
2、器材
显微镜，载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，乳酸苯酚，吸水纸等。
三、实验方法 1.菌落的活体观察
取培养皿用肉眼观察菌落的大小形态，正反面颜色、质地、饰纹边缘、颗粒物（闭囊壳、菌核等）。 2.制片观察：
(1) 制片：取干净载玻片——加1滴乳酸苯酚——在菌落中心与边缘之间钩出少量菌（带培养基）置于乳酸苯酚——加盖玻片煮微沸——镜检.(2) 观察：将制片放在显微镜下，用低倍镜观察菌丝的粗细、颜色、分生孢子头形态；曲霉顶囊大小、形态、可育面积、分生孢子梗粗细、
颜色、表面特征，有无横隔，小梗着生情况、大小、层数，分生孢子形态，大小，表面特征。
四、作业
1、出供试菌的形态并注明各部分的名称。
2、比较青霉和曲霉属霉菌的个体形态特点。
实验五 培养基的制备和常用器皿准备
一、实验目的
1.学会培养基的制备和常用器皿的准备方法 2.学会高压蒸汽灭菌及干热灭菌方法
二、原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。另外，培养基中一般含有适宜的pH值，一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
任何一种培养基制成后应及时的灭菌，以备培养菌使用，一般培养基灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验器材
1、试剂：马铃薯、葡萄糖、琼脂，营养琼脂、淀粉等。
2、器皿：移液管（1ml）、培养皿、试管、三角瓶、搪瓷缸、量筒等。
3、仪器：高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱。
4、其他：牛皮纸、纱布、棉花、棉线绳。
四、实验方法与步骤
1.PDA培养基的制备
马铃薯削皮——切块——称量——加水煮沸——过滤——往滤液中加葡萄糖、琼脂粉等——煮沸——分装——加棉塞——包扎——灭菌（湿热）。
2、营养琼脂培养基的配制
称量45克营养琼脂，加水至1000毫升，煮沸后分装，加棉塞灭菌。
3.灭菌水的制备（稀释用）
取9ml蒸馏水于试管中，塞棉塞，包扎后灭菌。 取225ml蒸馏水于500ml具塞三角瓶中，包扎后灭菌。 4.常用器皿准备：
a.移液管的包装 b.培养皿的包装
五、作业
1.高压蒸汽灭菌和干热灭菌各适用于哪些物品？ 2.两种灭菌技术应注意哪些关键操作？ 3.培养皿等干热灭菌前包扎的目的？
实验六 微生物的分离培养和接种方法
一、实验目的
1、掌握稀释分离和平板划线获得微生物纯种的方法
2、学会微生物接种技术
二、原理
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
三、实验器材
1、材料：土壤、粮食或者食品。
2、培养基：PDA培养基、营养琼脂培养基。
3、器皿：三角瓶、移液管、试管、培养皿、玻璃刮铲、酒精灯、接种环等。
4、仪器：电炉、恒温培养箱。
四、实验方法
1、微生物的纯种分离
（1）稀释涂布分离法：制平板—制菌悬液—涂布—培养—获得纯种微生物。
（2）平板划线法：制平板—制菌悬液—划线—培养—获得纯种微生物。
2、微生物的接种 （1） 斜面接种
五步曲：a.接种环灭菌 b.拔棉塞及试管口灭菌 c.接种 d.塞棉塞 e.接种环灭菌
（2） 培养皿接种：（霉菌形态观察及鉴定用） 倒平板—接种（单/三点接）—接种环灭菌
五、作业题
1、为什么用稀释法和平板划线法能获得微生物纯种？
2、霉菌平板接种为什么要使平板倒置？
3、要求根据实验结果写一篇论文，字数在2000字左右。
