授课教师 学生人数 55 课 题 实验二 植物基因组DNA的提取 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学目的 掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理与方法 教学重点 理解每一步实验操作的目的 教学难点 实验操作过程中的一些注意事项 教学过程
一、背景知识
1.DNA在细胞中存在的位臵？植物细胞DNA存在的位臵和动物细胞有何不同？（图） 教学用具 多媒体
2.DNA的存在形式
双螺旋结构图
双螺旋结构组成
染色体是怎样形成的？
一级结构（核小体=双螺旋+组蛋白）-二级结构（螺线管）-三级结构（超螺线管）-四级结构（染色体）
真核生物基因组DNA是经过四级包装形成了染色体，先是DNA形成双螺旋结构，再与组蛋白形成核小体（一级结构），压缩7倍，再形成螺旋管（二级结构），压缩6倍，之后再形成超螺旋管（三级结构），压缩40倍，最后超螺旋管压缩形成染色体（四级结构），再压缩5倍，正常细胞中基因组DNA是以染色质（相当于一级结构）形式存在，在细胞分裂的中期以染色体形式存在，真核生物细胞质DNA主要是以裸露的环状DNA形式存在，没有核小体结构。
3.遗传物质核酸除了DNA外还有另外一种，即RNA，它与DNA在结构上的区别？（图）
RNA基本单位中间的五碳糖是核糖，含氮碱基尿嘧啶（U）替代 胸腺嘧啶（T） 4.核酸的理化性质
（1）形状：DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈白色粉末或结晶。
（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、异丙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。 （3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。
二、实验目的
1.掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因组DNA的实验方法
三、实验原理
1.核酸在细胞中的存在方式，
是以核酸-蛋白质复合物的形式存在，如一级结构核小体（图）：DNA螺旋+组蛋白
2.通过低温研钵破坏植物细胞壁
3.加入CTAB溶解细胞膜，CTAB与核酸形成核酸-CTAB复合物，使核酸与蛋白质分离。
4.加入高盐溶液溶解核酸-CTAB复合物，加入蛋白质变性剂使蛋白质变性沉淀出来，离心除去蛋白质。 5.加入核酸沉淀剂，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出来，离心得到核酸沉淀。
四、实验仪器 1.水浴锅
2.离心机（12管）：3台 3.研钵：10个
4.移液枪（包括枪头）：1ml、400ul
五、实验材料与药品
实验材料：新鲜菠菜叶片 1.十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）
作用：溶解细胞膜并与核酸结合，便于分离核酸。 商品信息：瓶装/100g。
理化性质：白色或浅黄色结晶体至粉末状，有刺激气味，易溶于异丙醇，可溶于水,震荡时产生大量泡沫，化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。有吸湿性，在酸性溶液中稳定；溶于10份水，溶于热水、乙醇、三氯甲烷,易溶于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。
储存：在阴凉，干燥，通风良好的地方，远离不相容的物质。 危害：高毒，对皮肤及粘膜刺激性小，有轻微脱脂作用。 2.1M Tris-HCl PH8.0缓冲液
作用：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液
理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。
储存：室温保存。
危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。 3.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）
作用：螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。
商品信息：瓶/250g。
理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。
储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。
危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。 4.Tris饱和酚
作用：强蛋白质变性剂。 商品信息：瓶/250ml。
理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。
储存：4℃避光保存。
危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。 5.β-巯基乙醇（2-巯基乙醇）
作用：提供一种还原剂，这样酚类物质（植物材料特别是老的材料中含有大量的酚类物质）就不能被氧化成醌（醌易与DNA发生共价结合，使DNA发生褐变，从而影响你提DNA的实验）。巯基乙醇兼有消除CTAB震荡时产生的泡沫的作用。
商品信息：瓶/100g。
理化性质：无色透明液体，具有少许硫醇气味。易溶于水，乙醇和乙醚等有机溶剂，与苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。
储存：对空气敏感，易吸潮。 使容器保持密闭，储存在阴凉、干燥通风处。打开了的容器必须仔细重新封口并保持竖放位臵以防止泄漏。建议贮存温度 2- 8℃。
危害：高毒吸入、摄入或经皮肤吸收后会中毒。 对环境有危害，对水体可造成污染。 本品可燃。 6.氯化钠（NaCl）
作用：CTAB-核酸复合物在高盐溶液中易溶。 商品信息：瓶/500g，分析纯AR。
理化性质：白色晶体状。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨；不溶于浓盐酸。在空气中微有潮解性。稳定性比较好。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。 危害： 7.无水乙醇
作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。 商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。
理化性质：无色澄清液体。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。 储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。
危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。 8.氯仿（三氯甲烷）
作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的少量酚（酚易溶于氯仿）。 商品信息：瓶/500ml。
理化性质：无色透明液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。 储存：保存在密封的棕色瓶中。
危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。 9.异戊醇
作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
商品信息：瓶/500ml。
理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。
危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。 10.异丙醇
作用：DNA沉淀剂，DNA在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全，而后由于异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇，乙醇挥发快。用-20度预冷异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好；异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失；所以多选用-20度预冷异丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分钟就可以将异丙醇沉淀的核酸紧密的离到管底。
商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。
理化性质：无色透明具有乙醇气味的可燃性液体。有似乙醇和丙酮混合物的气味，能与醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于盐溶液。
储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、卤素等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。
危害：微毒类，高浓度蒸气具有明显麻醉作用，对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经。常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。 11.PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）
作用：PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
商品信息：白色塑料瓶/100g。
理化性质：白色或乳白色粉末或颗粒，有微臭。溶于水、碱、酸及极性有机溶剂。 储存：室温干燥保存。 危害： 12.液氮（LN2）
作用：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全；低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNAase的作用，保护DNA。 商品信息：分析纯
理化性质：-196℃。液态的氮气。是惰性的，无色，无臭，无腐蚀性，不可燃，温度极低。 储存：储存于阴凉、通风的库房。库温不宜超过30℃。 危害：汽化时大量吸热接触造成冻伤。
六、实验试剂
1.氯仿-异戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）40ml {氯仿-异戊醇（24:1）20ml + Tris饱和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → → 定容到50ml → 高压灭菌后冷却4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {蒸馏水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH（约2g）调至PH8.0 → 定容至100ml → → 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。 【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 4.2%CTAB抽提液 250ml
{CTAB 4g + 无水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml烧杯中 → 加热溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl（PH8.0）20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高压灭菌冷却后加入 → {1%β-巯基乙醇（400ul）2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存 【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加热到80℃溶解冷却后 → 定容至100ml → 高压灭菌备用 【1%（v/v）β-巯基乙醇】配制：10ml {β-巯基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巯基乙醇10ml 5.蒸馏水
所有药剂用水都要纯净水经高压灭菌冷却
七、实验步骤
（一）实验前准备
1.研钵、异丙醇-20℃预冷；【研钵10个、异丙醇75ml】
2.将2%CTAB抽提液从4℃冰箱内取出在65℃水浴预热；【CTAB抽提液30ml】 3.称取30份新鲜菠菜叶片，每份1g，称重时去叶脉；【菠菜叶片30g】 4.用蒸馏水冲洗叶片，滤纸吸干水分，将叶片用剪刀剪小。【洗瓶、滤纸、剪刀】
5.实验器材：冰箱、65℃水浴锅、液氮、10ml离心管90个、药匙、移液枪（1ml、100μl、400μl）、离心机（10000r/min）
6.实验药剂：酚-氯仿-异戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-异戊醇60ml（每管2ml）、无水乙醇12ml（每管400 μl）、TE缓冲液3ml（每管100μl）
（二）破碎细胞，释放溶解核酸
1.将叶片臵于预冷的研钵（实验前-20℃预冷）中，倒入液氮，尽快研磨成粉末；
目的：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全；低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNase的作用，保护DNA。
2.将粉末加入10ml离心管中，加入 1ml预热的CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀； 目的：CTAB可以溶解细胞膜并与DNA结合，便于分离DNA。加入β-巯基乙醇和PVP-40的目的是减少植物中酚类物质的影响。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。Tris-HCl提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。高盐溶液可以更好的溶解核酸-CTAB复合物。
3.将离心管臵于 65℃的水浴中保温40分钟，期间每隔10分钟轻轻摇晃几次。 目的：水浴使CTAB抽提液和叶片充分反应。
（三）抽提去掉蛋白质
1.将水浴的离心管取出，冷却 2分钟后，加入1ml酚-氯仿-异戊醇，振荡 2分钟，使两者混合均匀，12000 r/min离心10分钟； 目的：第一次离心溶液分3层，上-中-下层：CTAB-核酸-变性蛋白-有机溶剂
2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10 ml离心管中，加入2ml氯仿-异戊醇，轻轻颠倒离心管，混匀，12 000r/min离心10分钟。 目的：第二次离心进一步去掉变性蛋白，去掉多余的酚
（四）沉淀核酸
1.小心取上清液（含CTAB-核酸）臵于一个新的10ml离心管中（尽量避免吸取中间层）,加入2.5ml的异丙醇（-20℃预冷），将离心管慢慢上下摇动30秒，使异丙醇与水层充分混合，室温放臵15分钟至能见到DNA絮状物； 目的：异丙醇为DNA沉淀剂，异丙醇与CTAB互溶，但不与核酸相溶。用-20℃预冷的异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好，异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分核酸溶解损失；所以多选用-20度预冷异丙醇。核酸在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全。异丙醇易溶于CTAB，但不与核酸相溶。 2.10000r/min离心10分钟,小心倒去上清液。 目的：第三次离心使核酸沉淀到管底。
（五）核酸的洗涤
用400ul无水乙醇洗涤核酸沉淀直至无色，10000r/min离心10分钟，倾去上清液晾干。 目的：异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇及多余的NaCl，乙醇挥发快。
（六）保存
向下层离心物中加入100μl TE缓冲液进行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次课用。 目的：一般长期保存DNA，贮存在TE缓冲液中比较好。TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金属离子，从而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA会影响下游酶切，连接反应以及质粒转染进细胞的效率，如果接下来要做这些实验是应该避免使用含EDTA的缓冲液的。短期储存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA连接等效果。
八、实验注意事项
1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；
3.磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低温状态； 4.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔； 5.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；
6.将异丙醇吸出时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。
九、思考题
1.本实验中用到的各种试剂的作用是什么？ 2.本实验中进行了几次离心操作，每次的目的？
十、实验安排
全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。 每组作3个离心管，共用一个研钵。
每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。
