决明炭疽病菌生物学特性研究
沈凤
（四川农业大学 农学院，四川 成都，611130）
摘 要: ：对决明炭疽病果组织进行分离、病原茵鉴定及其生物学特性测定。结果表明，该病原菌初步鉴定为胶孢炭疽Colletotdchum gloeosparioides Penz．.本实验主要研究了光照、温度、pH值、湿度、碳氮源等因素对决明炭疽病生长、产孢和分生孢子萌发的影响。结果表明,光照条件对该菌菌丝生长、产孢和分生孢子萌发的影响不明显。该菌的菌丝生长温度范围为15～35 ℃,最适生长温度30 ℃;在pH 3～12 的范围内均能生长,最适pH范围为5～7。分生孢子在15～30 ℃都能萌发,最适萌发温度是25 ℃;在pH 3～10 范围内都能萌发,最适萌发pH 为6～8。在相对湿度低于97 %时,分生孢子不能萌发。该菌可以利用多种碳源和氮源,在供试碳氮源中,菌丝生长的最佳碳氮源分别是蔗糖和酵母粉而孢子萌发的最佳碳氮源分别为麦芽糖和酵母粉。 关键词:生物学特性 炭疽病 决明
Identification and Biological Characteristics of Colletotr ichum Gloeosporioides on Semen caiaen；
Abstract：The identification and biological characterization of the pathogen isolated from Semen caiaen induced by anthracnose were studied in this paper．The results showed that the pathogen was Colletotrlchum gloeosporioides Penz.The effects of illumination , temperature, pHvalue,humidity , carbon source and nitrogen source on the mycelialgrowth , sporulation and conidial germination of Colletotrichum gloeosporioides Penz．was primarily studied.The results showed that illumination have no much effect on the mycelial growth , sporulation and conidial germination of the fungi.Its mycelium grew between 1512 , and optimum pH volue was between pH 530℃, and optimum was at 25 ℃, It germinate between pH 38．The pathogen could use a variety of carbohydrates and nitrogen sources , but for the mycelial growth , the optimum carbon source was sucrose , and the optimum nitrogen source was yeast.For the sporulation , the optimum carbon source was maltose , and the optimum nitrogen source was yeast.Key words：：Biological characteristics；Colletotrichum gloeosporioides Penz；Semen caiaen；
决明为CaiatoraL.别名草决明。决明的种子为决明子，英文名CaiaSeed：拉丁名药材为Semen caiaen，决明子是我国传统中药，具有清肝明目、润肠遁便的作用，用于治疗各种眼科疾病[1]。
现代药理学研究又表明，决明子还具有降血压、降血脂，保肝及抑菌等活性，被应用于多种降脂最早记录在《神农本草经》中．目前我国23个省市有大规模种植，绝大部分分部在安徽，广东，广西，四川，浙江，山西等省。决明属(Caia L)全世界
[3]约有600种，我国产10余种，引种栽培lO余种，均可药用，对其种子研究较为深刻的有，减肥的成方制剂中徐国钧对小决明种子进行了粉末鉴定；秦波对钝叶决明和小决明进行了生药学研究。然而据
[4]
[5][2],田间调查发现，炭疽病(Colleto．wichura gloeosporioides Penz．)是决明子生产中发病最严重的病害之一，该病害在决明生长期内发病呈上升趋势，且主要危害果实，严重影响了决明子的产量和品质 。通过文献检索，国内其他关于炭疽病生物学特性的研究[8-12较多，却尚未发现对决明炭疽病的研究报道，本实验从采集炭疽病标样，对其进行分离鉴定，并对病原菌生长的营养成分、环境因素等生物学特性进行研究，为科学防治该病害提供理论依据。
1 材料与方法
试验于2011年3月至2010年5月在四川农业大植物病理系实验室进行。 1.1 试验材料
采集四川省成都市具有病斑的炭疽病病叶，按常规方法进行组织分离[6]，单孢纯化后，根据柯赫氏法则和形态学鉴定[7]
后获得供试菌株，并于PDA培养基上培养7 d后用于下列实验。
1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g，琼脂粉18 g，葡萄糖15 g，定容至1 ooo mL；燕麦培养基：称取燕麦50g，加水煮沸20min，四层纱布过滤，加入琼脂粉18 g，定容至1 000mL；胡萝卜培养基：胡萝卜200 g，琼脂粉18 g，葡萄糖l5 g，定容至1 000 mL；玉米粉培养基：称取玉米粉200 g，加水煮沸20min，四层纱布过滤，加人琼脂粉18 g，定容至1 000mL；查氏(Czapek)培养基：NaNO3 3 g，K2HPO4 l g，KC1 0．5 g，MgSO4-7H20 0．5 g，FeSO4 0．01 g，蔗糖30 g，定容至l 000 mL；绿豆培养基：称取绿豆200 g，加水煮沸20min，四层纱布过滤，加人琼脂粉18 g，葡萄糖l5 g，定容至1 000mL；西红柿培养基：称取西红柿200 g，加水煮沸20min，四层纱布过滤，加人琼脂粉18 g，葡萄糖l5 g，定容至1 000mL；
1.3 病原菌的鉴定
病原菌的分离培养采用常规的组织分离法， 将采集的病叶先用洗洁精清洗叶片， 自来水冲洗干净，切取病健交界处4 mm× 4 mm 的叶片及枝干小块， 放入75％酒精消毒15~30 s， 然后将其转入0.1％升汞消毒30 s， 用无菌水清洗3 遍后， 用灭菌滤纸吸干组织块， 植入倒好的PDA 培养基平板上。28 ℃恒温下培养， 2 d 后及时挑取菌种进行纯化， 经单孢分离后保存在PDA 培养基试管斜面上。7 d 后镜检观察菌丝、孢子的形态， 并进行病原菌鉴定。
1.4病原菌生物学特性的测定 1.4.1 培养基对菌丝生长的影响 将灭菌打孔器（直径7 mm）打取菌落边缘， 分别将菌饼接种于PDA、燕麦培养基、胡萝卜培养基、玉米粉培养基、Czapek、绿豆培养基和西红柿培养基平板中央， 且菌丝面朝下（下同）， 放置在28 ℃生化培养箱中培养。5 d 后用十字交叉法测量菌落直径， 每处理3次重复（下同）。
1.4.2 不同外源糖的PDA 培养基对菌丝生长、孢子萌发的的影响
PDA 培养基是以ω（葡萄糖）=0.02 作为碳源。分别以相同含纯碳量的蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、木糖、阿拉伯糖取代基础培养基PDA 中的葡萄糖， 配制成相同含碳量不同碳源的培养基， 经高压灭菌后接种， 以不加碳源作为对照， 每处理重复3次。28 ℃培养， 培养至第5 天用十字交叉法测量菌落直径。；并在培养基上加人0．05％吐温一80无菌水10 mL，用三
角刮片轻轻刮取菌丝，制成悬浮液，用血球计数板进行产孢量计算，每处理重复3次。
1.4.3 不同外源氮的Czapek培养基对菌丝生长、孢子萌发的的影响[16] 分别加入与硝酸钠含纯氮量相同的尿素、甘氨酸、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸铵、甘氨酸6种氮源制成添加不同外源氮的Czapek培养基， 以不加氮源作为对照， 每处理3 次重复。接菌后28 ℃培养， 培养至第5天用十字交叉法测量菌落直径。；并在培养基上加人0．05％吐温一80无菌水10 mL，用三角刮片轻轻刮取菌丝，制成悬浮液，用血球计数板进行产孢量计算，每处理重复3次。 1.4.4 温度对菌丝生长影响[17]
将菌饼接至PDA 培养基中央， 分别在
5、
10、20、
25、
28、
35、40 ℃的恒温条件下培养5 d， 观察菌丝生长情况， 每天用十字交叉法测量菌落直径的大小。 1.4.5 不同pH 值对菌丝生长的影响
用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 溶液调节灭菌的PDA培养基， 制成pH 值分别为
3、
4、
5、
6、
7、
8、
9、
10、11 共9 种PDA 培养基， 倒平皿后， 将菌饼移至平板中央， 在28 ℃恒温下培养， 用十字交叉法每天测量菌落直径的大小， 连续测量5 d。求其平均菌落直径。（红毛丹）
1.4.6光照对菌丝生长的影响
在培养7 d的菌落边缘，用打孔器打取直径为0．5 cm 的菌饼，移人l5 mL PDA平板上，25℃下，分别置于24 h光照、12 h、12 h光暗交替和24 h黑暗3种光照处理下培养，各处理重复3次，7 d后测量菌落直径。（草莓）
2.结果与分析
2.1 病原菌鉴定
2.1.1 病原菌的形态
在PDA 培养基上菌落圆形， 边缘整齐， 气生菌丝浓密， 初为白色， 后转为灰白色， 背面暗褐色， 培养后期分生孢子团桔红色。分生孢子梗无色， 分生孢子无色， 单孢， 正直， 长椭圆形或棒形， 两端钝圆， 内含颗粒状物， 细胞中央含油球， 大小为13.07~17.15 μm×4.11~6.21 μm。病叶上分生孢子盘圆形或卵圆形， 隆起， 浅褐色， 盘内密生分生孢子梗， 梗上长有分生孢子(图1)。不同菌株的菌丝生长速度、分生孢子大小和产孢量有差异， 根据分生孢子的形态特征鉴定该病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichunm gleosporiodes（Penz.）Sacc.）， 属半知菌亚门， 腔孢纲， 黑盘孢目[18-20]。
2.1.2 决明炭疽病菌rDNA ITS序列分析。
采用CTAB法提 取2个木薯炭疽病菌菌株的基因组DNA后，用通用引物 1TS1和ITS4进行PCR扩增，均获得大小约为0．6 kb的扩增条带。扩增产物克隆后各挑3个阳性克隆测序后进行比对 ME平板上，以确认其序列，结果表明2个序列长度均为575 nt，序列已提交GenBank，登录号分别为GQ865569和GQ424104。2个序列在http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／上的比对结果表明，这2个菌株的ITS序列之间有2个碱基的差异。菌株CCGHN01 (GQ865569)和l株同小丛壳围分离物(Glomerella cingulata)的ITS序列(EU671076．1)完全一致，和数个胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)分离物ITS序列(FJ459927．
1、EU520081．
1、GQ120498．1等)的同源性为99％。由于胶孢炭疽菌的有性态是围小丛壳，因此这2个菌株从分子水平鉴定为胶孢炭疽菌。
2.2 病原菌的生物学特性
2.2.1 培养基对菌丝生长的影响
从表1可见， 除水琼脂培养基外， 炭疽病菌在其余5种培养基上都能生长。其中在PDA、CA 和CZ 上长势较好， 气生菌丝丰富， 产孢较多；OA 次之， 在CMA 上生长较差， 菌落生长速度慢， 气生菌丝较少。
表1 培养基对菌丝生长的影响
培养基
菌落平均直径
差异显著性
差异显著性
菌丝体生长
（p
(p
说明：“+”表示菌丝较少或者稀疏，“++”表示菌丝较量一般，“+”表示菌丝量较多，大小写字母不同表示差异性显著。下同。
2.2.2 不同外源糖的PDA 培养基对菌丝生长、孢子萌发的的影响
从表2可见，加入不同的外源糖培养基上的长势基本上比在PDA的菌株长势要好。其中， 在外加鼠李糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和木糖6 种外加碳源的培养基上生长较好， 在含山梨糖的培养基上生长最差， 培养5 d 菌落平均直径只有5.20 cm， 低于对照PDA 培养基上的平均菌落直径5.94 cm。说明除山梨糖外， 外源糖对病菌的生长有明显的促进作用。 表2不同外源糖的PDA 培养基对菌丝生长、孢子萌发的的影响
碳源
菌落平均直径 （mm）
差异显著性
产孢量（×108个∕ML）
差异性显著
（p
（p
葡萄糖
蔗糖 麦芽糖 果糖 可溶性淀粉 木糖 阿拉伯糖
2.2,3 不同外源氮的Czapek培养基对菌丝生长、孢子萌发的的影响
从表3可见，病菌在加入不同外源氮的培养基上均能生长， 除加入苯丙氨酸PDA 培养基上菌落的生长速度受到抑制外， 其余氮源的加入对病菌的生长都有一定的促进作用。总体上， 无机氮源对病菌的生长作用优于有机氮源， 在硝酸钠、硫酸铵和氯化铵的PDA 培养基上病菌的生长最好，培养5 d 菌落平均直径达7.50 cm 以上。 表3 不同外源氮的Czapek培养基对菌丝生长、孢子萌发的的影响
氮源
菌落平均直径 （mm）
差异显著性
产孢量（×108个∕ML）
差异性显著
（p
（p
硝酸钠 尿素 甘氨酸 蛋白胨 酵母浸膏 硫酸铵 甘氨酸
2.2.4温度对菌丝生长影响
结果(见图1)表明，红麻炭疽病菌菌丝在12～30~C温度范围内均能生长，其中20～30℃温度范 围内菌丝生长较快，25℃时最适菌丝生长。
48474645444342第一季度第二季度第三季度第四季度北部
1．陈洁，刘红，苏佩清．决明子对心血管系统的药理作用研究进展．中国中医药杂志信息．2005，12(7)：109一110 2.钟先锋，邓泽元，黄桂东．决明孑有效成分的提取．南昌大学学报，2004，8(1)：96-98 3.张景，决明子有效成分的提取和分离, [硕士学位论文]，辽宁：大连轻工业学院图书馆,2006
4.徐国钧．中药材粉末显微鉴定．北京：人民卫生出版社，1986，524 5．秦波，楼之岑。常用重要材品种整理和质量研究．北京：北京医科大学，中国协和医科大学联合出版社，2003。348 6.方中达．植病研究方法[M]．北京：中国农业出版社，1998．153一l54． 7.陆家云．植物病原真菌学[M]．北京：中国农业出版社，2001 [8] Estrada A B， Dodd J C, Jeffries P.Effect of humidity and temperature on conidial germination and apperorium development of two Philippine isolates of the mango anthracnose pathogen Colletotrichum gloeosporioides[J].Plant Pathology， 2000， 49： 608-618.[9] 谢丙炎， 欧阳本友.辣椒炭疽病菌生物学特性的研究[J].微生物学通报， 1992， 19（6）： 321-324.[10] 刘爱媛.大白菜炭疽病菌生物学特性的研究.湖南农学院学报[J].1992， 13（增刊）： 171-176.[11] 王芳， 曾华英， 杨福祥， 等.芦荟炭疽病菌生物学特性及防治的研究[J].中国农学通报， 2001， 17（2）： 24-26.[12] 吴芳芳， 檀根甲， 何德友， 等.苹果采后炭疽病菌生物学特性的研究[J].菌物系统， 2002， 21（3）： 440-443.
[16] 蒲金基， 张欣， 谢艺贤， 等.香蕉黑星病菌形态与生物学特性[J].果树学报， 2006， 23（4）： 576-580.[17] Estnrada A B, Dodd J C, Jeffries P.Effect of humidity and temperature on conidial germination and apperorium development of twophilippine isolates of the mango anthracnose pathegen colletotrichum gloeosparioidec[J].Plant Pathology, 2000, 49: 608-618.[18] 许志刚.普通植物病理学[M].北京： 中国农业出版社， 2006: 118-119.[19] 陆家云.植物病原真菌学[M].北京： 中国农业出版社， 2001: 454.[20] 张中义， 泠怀琼， 张志铭， 等.植物病原真菌学[M].成都： 四川科学技术出版社， 1988: 395.
